Легендарная система CRISPR, которая не перестаёт удивлять учёных своими возможностями, показала новый фокус. Оказалось, что система, вызвавшая революцию в редактировании генов, может также использоваться в тестах на выявление опасных патогенов. Тестов, заметим, быстрых и дешёвых.
Этого высокочувствительного кролика из шляпы генотипирования достали специалисты из Института Броуда Массачусетского технологического института (MIT). Напомним, ранее именно они официально выиграли битву за патент на метод генетического редактирования CRISPR.
Совместно с коллегами из Гарварда и других научных центров MIT американские исследователи на основе технологии CRISPR-Cas13a создали метод для выявления патогенов, генотипирования и мониторинга генетических заболеваний. Он получил название SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing). Но не потому, что всё элементарно, а из-за своей эффективности.
Поясним, что далеко за пределами микро, нано и пико живёт атто – метрический префикс, представляющий 10-18. Это и есть царство диагностической системы SHERLOCK, которая способна обнаружить вирус на аттомолярном уровне и даже различить родственные вирусы – например, Зика от лихорадки денге.
Ключевым элементом новой технологи стала нуклеаза Cas13a. Это фермент, который способен избирательно разрезать только РНК. Летом 2016 года специалисты института Броуда опробовали эту систему (тогда она называлась C2c2) для "заглушки" генов бактерий E. coli.
По своим функциям нуклеаза Cas13a схожа с широко известной Cas9, но есть и принципиальные отличия. Во-первых, Cas13a работает на уровне РНК, а не ДНК (потому что у некоторых вирусов именно РНК является носителем генетической информации). Во-вторых, она не разрезает свою "мишень", а просто уничтожает её: после обнаружения чужеродной РНК фермент Cas13a начинает уничтожать все молекулы РНК вокруг.
Для редактирования генома такой метод, конечно, не подходит, зато в других целях он может быть очень полезным, заключили исследователи. "Как только мы поняли, как работает фермент, мы увидели, что он может иметь неограниченные приложения в диагностике", — говорит член команды Омар Абудейя (Omar Abudayye).
Так появилась система детекции нуклеиновых кислот SHERLOCK, которая позволяет быстро и точно выявлять различные штаммы вирусов, различать патогены, а также генотипировать ДНК и определять опухолевые мутации во внеклеточной ДНК (которая циркулирует в плазме крови).
Основная сложность подобной диагностики состоит в том, что в образце крови или мочи пациента может быть слишком мало молекул, содержащих вирусную РНК. Как рассказал соавтор исследовани Фэн Чжан (Feng Zhang), чтобы добиться аттомолярной чувствительности, его команде пришлось сперва подобрать условия предварительной амплификации (метода увеличения количества нуклеиновых кислот). Чтобы Cas13a заметил даже небольшое количество "плохих" РНК, исследователи использовали рекомбиназную полимеразную амплификацию — технологию, позволяющую многократно размножать присутствующую в образце РНК. Кроме того, учёные добавили к системе обнаружения особую РНК, которая при разрушении ферментом начинает светиться. Благодаря этому специалист может убедиться, что фермент достиг цели.
Эффективность метода команда протестировала на лентивирусах, содержащих геномные фрагменты вируса Зика и лихорадки денге. SHERLOCK распознал вирусные частицы, концентрация которых не превышала двух аттомоль, и при этом смог различить два этих типа между собой.
Кроме того, метод прошёл проверку на образцах мочи, слюны и сыворотки крови, и во всех случаях он успешно выявил нуклеиновые кислоты с концентрацией около трёх аттомоль. К примеру, в генах бактерий Klebsiella pneumoniae тест выявил устойчивости к антибиотикам.
Ещё одним испытанием (которое прошло успешно) стало определение гомо- и гетерозиготных мутаций. Учёные выяснили, что система способна распознавать даже однонуклеотидные замены – отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид.
Наконец, команда решила проверить, как система справится с поиском внеклеточных фрагментов ДНК с раковыми мутациями, свободно плавающими в образцах крови. Из-за большого количества обычной ДНК подобный поиск обычно проходит крайне сложно, однако SHERLOCK зафиксировал даже 0,1% концентрацию нуклеиновой кислоты, несущей раковые мутации.
Примечательно, что такой высокочувствительный тест не требует каких-то специфических условий: он прост как тест на беременность, а для его проведения требуется лишь стекловолокнистая бумага.
Кстати, занимает такая высокоточная диагностика несколько часов. Стоимость также поражает: по оценкам авторов, цена теста составит в будущем примерно 61 цент (или 35 российских рублей). Благодаря такой простоте и дешевизне, новый метод диагностики станет доступным для стран третьего мира, где находятся очаги многих вирусных заболеваний, а здравоохранение оставляет желать лучшего.
Сейчас команда разработчиков ищет способы коммерциализировать метод диагностики, в частности рассматривается вариант запуска отдельного стартапа. Однако прежде чем тест SHERLOCK появится на медицинском рынке, ему предстоит пройти проверку в регулирующих ведомствах, в частности – в Управлении по контролю за продуктами и лекарствами США.
Более подробно уникальный метод диагностики описан в статье, которая была опубликована в журнале Science.
Кстати, ранее китайские учёные впервые испытали метод CRISPR на жизнеспособных человеческих эмбрионах. Тем временем специалисты Сколтеха раскрыли подробности работы системы бактериального иммунитета CRISPR-Cas.
Напомним также о создании ещё одного нового метода диагностики – химического анализа волос.
